Crispr/cas系统基因编辑用核酸内切酶Cas9,Cas12a,Cas12b,Cas13a,Cas14a区别

CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。

上海惠诚生物提供Crispr/Cas系统用核酸内切酶：Cas9，Cas12a，Cas12b，Cas13a，Cas14a。

从下表中可以看出不同Crispr酶在向导RNA，是否需要PAM和Target片段的区别。

Crispr酶向导RNA，PAM和Target表

Cas9的作用机制：

CRISPR-Cas9系统包括一个gRNA(或sgRNA) 和 Cas9 核酸酶，它们共同形成一个核糖核蛋白（RNP）复合物。Cas9 蛋白识别的 PAM 序列是 5'-NGG-3'，其中 N 代表任意核苷酸。如果 PAM 序列匹配正确，并且 gRNA 成功地与目标位点结合，那么 Cas9 会在 PAM 序列上游约 3-4 个核苷酸进行 DNA 双链的切割。

gRNA，也称为sgRNA（“ s”代表单写，它们是同一回事）。gRNA是人类人工制造的，自然界中不存在。这种gRNA设计基于自然存在的crRNA和tracrRNA。 核苷酸1–32是天然存在的crRNA。 核苷酸37-100是天然存在的tracrRNA。在两个片段之间添加了一个GAAA接头，使它们成为单个RNA片段。

Cas12的作用机制：

CRISPR-Cas12系统在向导RNA的引导下识别含PAM的dsDNA，然后促使靶标dsDNA解链，解链后的靶标dsDNA中的靶标链（TS）与向导RNA形成Rloop，近而释放出Cas12中的RuvC的活性位点；而刚刚解链后的靶标dsDNA中的非靶标链（NTS）此时就会被释放出的活性位点的RuvC切割；这一切割的结果造成靶标DNA的解旋，释放出的靶标dsDNA的TS被RuvC切割；当Cas12完成对靶标dsDNA中的TS和NTS的切割后（顺式切割），会释放出dsDNA，而此时空间被留出来的RuvC的活性位点，一旦有ssDNA进入，都会被切割（反式切割）。

CRISPR Cas12a蛋白和CRISPRCas12b蛋白是CRISPR Cas蛋白 Class2 V型中的亚型，V-A cas12a, 又叫cpf1; V-B cas12b, 又称 c2c1。Cas12b和Cas12a的主要区别是：

1. 核酸酶结构域不同，Cas12b蛋白的结构域是RuvC；Cas12a蛋白的结构域是RuvC和Nuc。

2. 向导RNA不同。Cas12b需要crRNA和tracrRNA；Cas12a只需要crRNA，不用tracrRNA。

3. 酶切方式不同。Cas12b酶切7个交错核苷酸；Cas12a酶切的是交错末端，5' overhangs。

4. 应用技术不同。Cas12b蛋白应用的技术是HOLMES v2；Cas12a‍蛋白‍应用的技术是DETECTR和HOLMES。

Cas13a的作用机制：

CRISPR-Cas13系统与crRNA、底物结合形成三元复合体后，Cas13蛋白被激活，此时Cas13蛋白不仅能切割底物RNA，还能切割游离在环境内的任意单链RNA。Cas13a蛋白和Cas13b蛋白是RNA酶，基于Cas13a和Cas13b的检测需要RNA聚合酶的转录步骤。

Cas13a只需要24个碱基的crRNA，它通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用，并通过Cas13a的一系列构象变化来促进目标的切割。与Cas9一样，Cas13a也能容忍crRNA与目标序列之间的单个错配，不过若存在2个错配，那切割效率就大大降低。它的PFS序列（相当于PAM序列）位于间隔区的3’端，由A、U 或C碱基组成。

Cas13a还有一个特别之处，那就是Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它将结合并切割其他的RNA，而不管它们是否与crRNA同源，或是否存在PFS。这一点与Cas9截然不同。对于细菌而言，这种性质是有意义的。若细菌被噬菌体感染，它能够激活程序性细胞死亡或休眠状态，以限制感染在整个群体中的传播。

像Cas13a一样，Cas13b仅需要单个向导RNA就能找到靶标，并且从遗传学的角度是可编码的。此外，Cas13b能够同时靶向多个RNA转录本。但Cas13b也有一些独特的特点，表明它与Cas13a是不同的。这些特性使得Cas13b更适用于微调基因功能。

Cas14a作用机制：

Cas14a核酸酶是一种内切核酸酶，其在tracrRNA:crRNA（或sgRNA）的引导下，特异结合并切割靶标ssDNA，且无需PAM位点。相比于其他的Cas蛋白，Cas14蛋白的分子量普遍较小（400-700aa）；与Cas12类似，Cas14a也可以结合靶标核酸并激活其ssDNA反式切割活性，从而被应用于靶标核酸的分子检测；与Cas12不同的是，Cas14a只能结合ssDNA靶标，因此经过扩增富集的靶标核酸需使用T7核酸外切酶进行处理，且其中一条扩增引物需要使用磷硫酰化修饰以确保T7核酸外切酶仅切割其中一条链，从而留下ssDNA靶标链以用于Cas14a介导的分子检测。

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